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Résumé

La matrice extracellulaire (MEC) fournit une structure mécanique aux cellules incluses et donne des signaux biochimiques pour réguler l'homéostasie et la différenciation. La molécule structurelle fibronectine contient des motifs d'adhésion tels que la séquence RGD avec une haute spécificité pour les β1- et β3 -intégrines mais aussi des domaines de liaison pour le glycosaminoglycane (GAG) héparan sulfate (HS). Les GAG ont une grande capacité de gonflement en raison de leur charge négative mais interagissent également avec les facteurs de croissance pour les protéger de la dégradation et servent ainsi de réservoir. Le HS se lie à la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP2), connue pour son potentiel ostéoinductif et appliquée cliniquement pour guérir de grands défauts osseux en combinaison avec des échafaudages 3D. Dans le corps humain, les HS sont liés à des protéines centrales formant des protéoglycanes HS qui font partie de l'ECM ou apparaissent à la surface des cellules. Le rôle des HS extracellulaires et de surface des cellules, ainsi que des intégrines, dans la signalisation de la BMP2 et l'adhésion cellulaire fait actuellement l'objet d'un débat scientifique. Quelques études suggèrent que les HS exogènes régulent à la hausse la signalisation de la BMP2, tandis que les HS de surface des cellules influencent négativement la bioactivité de la BMP2. De plus, la BMP2 induit une adhésion cellulaire médiée par l'intégrine et le HS de surface cellulaire médiatise l'adhésion cellulaire à la fibronectine. Cependant, on ignore comment les intégrines influencent la signalisation de la BMP2 ou comment elles interagissent avec le HS immobilisé et la BMP2 adsorbée dans le cadre de la différenciation ostéogénique. En outre, la relation entre les HS exogènes et ceux de la surface cellulaire est rarement abordée. Nous répondons à ces questions en concevant des surfaces modèles biomimétiques 2D basées sur une monocouche de streptavidine, qui permet de co-immobiliser des molécules biotinylées d'intérêt et de les présenter aux cellules. Le ligand d'adhésion cRGD est co-fonctionnalisé avec des HS orientés sur lesquels la BMP2 s'adsorbe. Les densités de masse surfacique et la cinétique de liaison sont précisément caractérisées ex situ à l'aide de techniques sensibles aux surfaces telles que l'ellipsométrie spectroscopique (SE) et la microbalance à cristaux de quartz. Pour la première fois, nous appliquons la spectroscopie de corrélation d'image basée sur la fluorescence pour caractériser in situ les surfaces biomimétiques en termes de densité moléculaire et mesurer des valeurs comparables à la SE ex situ. Nous développons cette technique en la combinant avec le photoblanchiment pour révéler des informations sur le nombre moyen et la distribution des fluorophores par molécule afin d'augmenter la précision. Pour améliorer la reproductibilité et le potentiel de contenu élevé de notre approche biomimétique, nous avons créé un protocole automatisé pour fabriquer des plateformes biomimétiques homogènes à l'aide d'un robot de manipulation de liquides. A la demande de l'utilisateur, de multiples conditions indépendantes de la plateforme biomimétique peuvent être construites en parallèle dans des plaques à 96 puits et permettent d'étudier l'effet des membres de la famille des BMP à différentes concentrations adsorbés sur l'iHS. Tout d'abord, nous constatons que les β1- et β3-intégrines sont toutes deux fondamentales pour la signalisation BMP2-SMAD et l'expression de l'ALP dans les cellules C2C12, marqueurs de l'activité précoce de la BMP2 et de la différenciation ostéogénique, respectivement. De plus, la BMP2 liée à un HS exogène améliore la différenciation ostéogénique par rapport à la BMP2 directement immobilisée sur la plateforme et le HS soutient l'activité de la BMP2. Nous avons d'autres preuves que la BMP2 adsorbée sur le HS est plus bioactive que la BMP4, la BMP6 et la BMP7 en ce qui concerne la signalisation précoce de la BMP2. En plaçant des cellules CHO de type sauvage et celles présentant une déficience en HS à la surface cellulaire, nous révélons un effet positif du csHS sur la signalisation BMP2 à de faibles doses d'aBMP2, ce qui est en contradiction avec les résultats obtenus avec des doses plus élevées dans la littérature. Enfin, nous montrons que le csHS a un effet négatif sur la propagation des cellules sur les surfaces de cRGD et encore plus sur les surfaces présentant du cRGD et du HS exogène. Nous concluons que les plates-formes biomimétiques de streptavidine fabriquées automatiquement, caractérisées avec précision et hautement flexibles sont un excellent outil pour étudier l'influence combinatoire des facteurs de croissance, des GAGs et des peptides sur le destin cellulaire.